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《中国生物制品规程》冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程·

本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌,经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。

1 菌种

1.1菌种来源

基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。

1.2菌种特性

菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。

1.3制造用菌种库的建立

从原始菌种库传出,经扩大后冻干保存,或由上一代制造用菌种库传出,扩大后冻干保存作为制造用菌种库,但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定,合格后方可投产。

1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长。

1.3.2涂片革兰氏染色

在光学显微镜下观察,应为典型的革兰氏阴性杆菌。

1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌株相符。

1.3.4电镜检查

应为典型大肠杆菌形态,并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

1.3.6干扰素的表达量

在摇床培养,应符合原始菌种的表达量。

1.3.7质粒检查

应做该质粒的酶切图谱,并应与原始质粒相符。

1.3.8表达的干扰素型别

应用标准抗α干扰素血清做中和试验,证明型别正确。

1.4生产菌种

从制造用菌种库传出供生产用的菌种,称为生产菌种。

1.4.1生产菌种的制备及检定

取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2~3块,培养后挑取平板中5~10个菌落,分别培养后保存,然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定,至少重复一次,选出其中干扰素表达量最高的一份,供生产制备种子液用,其表达量应符合原始菌种的表达量。

1.5种子液

从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备:将1.4.1项检定合格的生产菌种,根据实际需要做扩充传代,作为罐培养的种子液。

2 发酵培养

2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。

2.2发酵培养基

应为适于发酵培养的培养基,根据菌种的抗生素抗性,培养若中允许加入少量抗生素,但应尽量避免含有β椖邗0防嗫股?亍?/P>

2.3发酵培养参数

根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。

3 收集菌体

用离心法或其他适宜方法收集菌体,菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。

4 菌体裂解

用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。

5 制备粗制干扰素

菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。

6 纯化

粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。

7 加白蛋白

取干扰素半成品原液检定合格后,立即另入适量人白蛋白保护剂,即为“加人白蛋白半成品”,保存于?/FONT>30℃。

8 稀释、除菌过滤

将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度,补加人白蛋白,使最终含量1%~2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌,除菌后抽样进行干扰素效价测定,热原质试验和无菌试验,合格后进行分装冻干。

9 分装、冻干

9.1 每支安瓿分装1ml,内含α2a干扰素100或300万IU。

9.2 冻干过程制品温度不得超过33℃。

9.3 冻干后成品置10℃以下干燥处保存,成品检定合格后进行包装。

10 半成品检定

每批半成品抽样进行10.1~10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9~10.12项检定。

10.1 效价测定

用细胞病变抑制法,Wish细胞/VSV为基本检测系统,用国家参考品校准为IU。

10.2 蛋白含量

用Lowry法测定。

10.3 比活性

应≥108Iumg蛋白。

10.4 纯度

10.4.1 电泳纯度

用非还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,经扫描仪扫描纯度应在95%以上,聚合体不得超过10%。

10.4.2 高效液相色谱纯度

用280nm检测,应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。

10.5 分子量

用还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,α2a干扰素分子量应为19KD±10%。

10.6 残余外源性DNA含量

用同位素或生物素标记探针法测定,每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。

10.7 残余鼠IgG含量

用酶标或其他敏感方法测定,每剂量(20μg)的鼠IgG含量应在100ng以下。

10.8 残余工程菌蛋白含量

用酶标或其他敏感方法测定,残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。

10.9 残留抗生素活性

半成品中不应有残余抗生素活性存在。

10.10 肽图测定

应符合α2a型干扰素图形,批与批之间图形应一致。

10.11 等电聚集

测定等电点,α2a型干扰素等电点应5.7~6.7范围内。

10.12 紫外光谱扫描

检查半成品的吸收光谱,批与批之间应一致,α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。

11 除菌半成品检定

11.1 效价测定

同10.1项。

11.2 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

11.3 热原质试验

按《生物制品热原质试验规程》进行,注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg,判定标准按该规程4.1项要求进行。

12 成品检定

12.1 外观

应为白色或微黄色疏松体,另入1ml灭菌注射用水溶解后,不得含有肉眼可见的不溶物。

12.2 pH值

pH值应为6.5~7.5。

12.3 效价测定

同10.1项。其效价应为标示量的80%~150%。

12.4 水分含量

应≤3%(g/g)。

12.5 鉴别试验

用中和试验法,其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。

12.6 HBsAg检测

用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定,应为阴性。

12.7 无菌试验

同11.2项,每批抽样不少于10支。

12.8 热原质试验

同11.3项。

安全试验

12.9.1 豚鼠试验

用体重300~400g豚鼠2只,每只腹侧皮下注射干扰素1ml,观察7天,局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。

12.9.2 小白鼠试验

用体重18~20g小白鼠5只,每只腹腔注射干扰素0.5ml,观察7天,动物全部存活,每只体重增加判为合格。

13 保存与效期

保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。