《中国生物制品规程》皮上划痕人用炭疽活菌苗制造及检定规程·

本品系用弱毒炭疽菌株制成的活芽胞悬液。专供预防炭疽病之用。

1 菌种

1.1 菌种来源

为无荚膜，水肿型，具有一定残余毒力，免疫原性较好的A16R菌株。由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2菌种应以冻干法或用50%(ml/ml)甘油保存。每3~5年应全面检定其培养特性、残余毒力、安全性及免疫力，建立种子批。生产前只检查菌形，培养特性及噬菌体特异性。

1.3菌种检定

1.3.1 培养及生化特性

在牛肉消化液琼脂或其他适宜固体培养基上生长，菌落为灰白色，不透明，呈卷发状。为革兰氏阳性大杆菌，呈链状排列。无运动力。能够形成芽胞。液体培养呈絮状发育，在血清培养基上不形成荚膜。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不分解水杨苷。

1.3.2 残余毒力试验

用体重350～400g健康豚鼠5只，各皮下注射0.5亿/ml的牙包悬液1ml。另用体重18～20g小白鼠5只，各皮下注射0.5亿/ml的芽胞悬液0.1ml。观察10天，3只以上动物应出现水肿，可有特异死亡。但脏器涂片只应找到无荚膜的本菌。若全部动物不出现水肿，应重试。重试仍无水肿，菌种不得用于生产。

1.3.3 安全试验

用体重2.0～2.5kg分健康家兔10只，各皮下注射2.5亿/ml的芽胞悬液1ml，观察10天，在注射部位可出现水肿，全部动物应活存。如有死亡，应用同数动物重试，重试仍有死亡，菌种不得用于生产。

1.3.4 免疫力试验

上述安全试验动物于注射后18～20天，用炭疽毒菌攻击，各皮下注射20个MLD。同时用同体重的健康家兔3只，各皮下注射1个MLD作为对照。观察10天，对照动物死亡3只。试验组保护60%；对照组死亡2只，试验组保护80%为合格。对照动物死亡1只或无死亡，为对照不成立，应重试。

2 制造

制造菌苗的工作室及设备应当专用，不得与其他细菌工作混用。生产中应严格执行无菌操作，非制造菌苗用的其他炭疽菌株不得带到生产工作室内。

2.1 菌种

接种牛肉消化液琼脂或其他适宜固体培养基，于34℃培育18～20小时，经检查为纯菌者，保存于2～8℃，在2周内供作生产种子用。

2.2 培养基

用pH7.2～7.4牛肉消化液琼脂或其他培养基。

2.3 种子

将供制造用菌种，移种于牛肉消化液中。于34℃培育20～24小时，检查其生长特性、菌形及纯度，应符合1.3.1项要求。

2.4 接种

经检查合格之种子培养物，接种于牛肉消化液琼脂上，置33～34℃培育。成熟的典型芽胞达至80%以上、无杂菌者采集。

2.5 采集

将培养物刮入50%（ml/ml）甘油蒸馏水原液瓶内，振摇使成均匀悬液。每瓶取样按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验。

2.6 合并

将纯菌试验合格之原液进行合并分批，取样做纯菌试验、浓度测定及活菌计数。

2.6.1 纯菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.6.2 浓度测定

按中国细菌浊度标准测定浓度。

2.6.3 活菌计数

取0.5亿/ml的菌液1ml，按10倍系列稀释至10-5。取10-5稀释菌液接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。置37℃培育24小时，计算每ml菌苗的芽胞活存率。芽胞活存率在50%以上为合格。

2.7 稀释分装

2.7.1 稀释

用灭菌的50%甘油蒸馏水将原液稀释成每ml含芽胞40亿个，即为皮上划痕用菌苗。同批原液稀释之菌苗为作1批。稀释若干大瓶时，应按瓶号分为亚批。

2.7.2 分装

皮上划痕用菌苗按20人份/ml分装。规格为每安瓿1或2ml，抽样进行成品检定。

3 成品检定

3.1 物理检查

应为灰白色之均匀悬液，无异物及摇不散之菌块。

3.2 纯菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3 浓度测定

按中国细菌浊度标准测定浓度，应为每ml含菌40亿±20%

3.4 活菌计数

按2.6.3项进行。

3.5 安全试验

每批菌苗用体重2.0～2.5kg，健康家兔5只，各皮下注射2.5亿/ml的芽胞悬液1ml。观察10天。可有水肿，全部动物应活存。如有死亡，应用加倍量动物重试。如仍有死亡，判为不合格。

3.6 免疫力试验

每5批菌苗或不足5批者，至少抽检1批（可利用安全试验的动物）按1.3.4项进行。

4 保存与效期

应保存于2～8℃。自检定合格之日起效期为2年。