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《中国生物制品规程》钩端螺旋体菌苗制造及检定规程·

本品系用各地区主要的钩端螺旋体流行菌型,经培育、杀菌后,按型别配成单价或多价菌苗,用于预防钩映螺旋体病。

1 菌种

1.1 菌种来源

制造菌苗用之菌种,由中国药品生物制品检定所分发或经同意。疫情需要时,新分离的菌种经与质量检定部门会同检定符合规程要求,并经中国药品生物制品检定所同意后方可用于生产。

1.2 菌种检定。

生产用的菌种应通过体重120~220g的豚鼠传代,2~3天后或濒死前抽取心血或摘取肝组织,接种生产用养基或其他适宜的培养基,并培育传至4代以上即可进行各项检定。

1.2.1 培养特性

将上述菌种搁于生产培养基,接种量在5%以下,28~32℃培育5~10天,钩端螺旋体菌数应达每视野100条/400x以上。培养物应透明,微带乳光,摇动时稍有云雾状混浊,菌形要求整齐,运动活泼,两端形成钩状。

1.2.2 血清凝集反应

用3~10天的活培养物,每视野50~100条/400x,运动良好,且无自凝的钩端螺旋体,与特异性血清做定量凝集反应,其凝集效价应达血清原效价之半。终点效价以菌数减少50%(++)为判定标准。新菌种要求用凝集素交叉吸收试验法定型。

1.2.3 毒力试验

用体重180~220g的健康豚鼠6只,分成两组,弱毒、强毒株分别各皮下注射培育5~10天,每视野50~100条/400x活培养物2ml。弱毒株注射后48小时抽取心血,按1%量接种于生产培养基或其他适宜培养基2支,培育14天,镜检。要求培育全部阳性,判为合格。强毒株注射后,观察10天,至少应有2只豚鼠因患钩端螺旋体病死亡,判为合格。

1.2.4 免疫力试验

用培育5~10天每视野70~100条/400x经56~58℃加温1小时或0.3%(ml/ml)苯酚杀死的钩端螺旋体培养物,以生理盐水做3倍稀释,免疫体重120~220g健康豚鼠3只(对照组3只应同时饲养),皮下免疫2次,第1次0.5ml,第2次1ml,间隔5天,末次注射后10~12天用同株或同型异株培育5~10天每视野50~100条/400x的培养物2ml进行皮下攻击。

强毒株:攻击后观察10天,免疫组豚鼠应健存,外观及食欲正常,不耸毛,运动活泼,体重增加,解剖无黄疸。对照组豚鼠至少应有2只患钩端螺旋体病死亡,判为合格。

弱毒株:攻击后,24小时抽取心血,接种2管5%~8%兔血清培养基,每管1~2滴(约为1%接种量)。培育14天。免疫组心血培养要求2/3以上为阴性,对照组均为阳性,判为合格。

1.2.5 抗原性试验

用培育5~10天每视野70~100条/400x经56℃加温1小时杀死的培养物,静脉免疫体重2.0~2.5kg的健康家兔3只,各按1ml、2ml与5ml,共注射3次,间隔5天,末次注射10~15天取家兔血清与同株培养物作凝集反应,至少应有2只家兔血清效价达到1∶10000以上判为合格。

1.3 菌各保存

1.3.1 钩端螺旋体菌种应保存于含兔血清培养基或其他适宜培养基内,存放在18~22℃暗处,定期传代保存或液氮保存。

1.3.2 为保存菌种的毒力及纯度,每传3~6代,应通过体重120~220g健康豚鼠一次,并同时做血清学特性检查。

2 菌苗制造

制造菌苗用的菌种每型可包括1~3株。

2.1 菌种

用体重120~220g的健康豚鼠,皮下注射培育5~10天生长良好的种子培养物2ml,注射后2~3天或濒死前抽取心血或摘取肝组织,按1%以下量接种于生产用培养基或其他适宜的培养基,28~32℃培育7~18天,个别不易生长的菌种可延至30天,经检查为生长良好,运动活泼的纯培养,方可用于大量接种。此外洗种法也可使用。液氮保存菌种复苏后即可用于生产。

第1代菌种须做纯菌试验及血清学特性检查。前5代接种量均不应超过10%。

制造菌苗所用之菌种不应低于4代(洗种法除外),最多不超过菌种检定许可的代数(从感染动物或复苏后接种第1代算起)。

2.2 培育

2.2.1 生产用培养基可用综合或半综合培养基。用10L大瓶或大罐通气培养时,经28~32℃培育5~14天,菌数应达300条/400x以上。取样作纯菌试验及镜检,应无杂菌。培养物可用适当的方法浓缩。

2.2.2 培养物用苯酚或其他适宜杀菌剂杀菌。苯酚含量为0.25%~0.35%(g/ml)。

2.2.3 加苯酚的菌液于配合后,混匀,至少放置30分钟,取样镜检菌体灭活情况,测苯酚含量。

大瓶培养应逐瓶做无菌试验。

2.3 菌苗配制

2.3.1 杀菌后,按预定比例将不同菌型培养物混合成1批。大罐培养亦可先合并后杀菌。若移至大瓶存放,应按前、中、后抽样做无菌试验。菌液如放置放半年以上。合并前应逐瓶重做无菌试验。

2.3.2 菌苗所含菌型应按当地主要流行菌型配合,5价以下(含5价)者,每型含菌数不低于1.5亿条/ml,各型配合比例,不应超过或低于计算量的10%。六价以上菌苗,每型含菌数不应低于1亿条/m.l,但菌苗的总菌数不应超过12.5亿条/ml。

2.3.3 菌苗中应加氯化钠,使其最后含量为0.75%~0.9%(g/ml)。

2.4 菌苗分批

同日合并的菌苗作为1批。大罐混合者,每罐作为1批,并按分装机分为亚批。

2.5 分装

分装后按亚批抽样,送质量检定部门检定。

3 成品检定

3.1 物理化学检查

应为微带乳光的液体,不应变色,无异臭,无摇不散的凝块及异物。PH值应为6.4~7.4。氯化钠含量应为0.75%~0.9%(g/ml)。苯酚含量不超过0.25%~0.35%(g/ml)。

3.2 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3 安全试验

3.3.1 防腐剂试验

用体重18~20g健康小白鼠2只,各皮下注射0.5ml,注射后战栗不得超过半小时,观察7天,应活存。局部不得有脓肿或坏死。

3.3.2 毒性试验

用体重18~20g之健康小白鼠5只,每只腹腔注射菌苗0.5ml,或用体重350~450g之健康豚鼠2只,腹腔注射菌苗0.5ml,观察7日,应无死亡。

3.4 免疫力试验

按成品菌苗所含菌型价数检定,用生理盐水将菌苗稀成每型含菌数0.5亿条/ml。每生产年度生产前3批均匀应做免疫力试验,以后每5批至少抽检1批。试验方法与判定标准同1.2.4项。

3.5 鉴别试验

采用反向间接炭凝集试验,按成品菌苗所含菌型价数与相应炭血清做炭凝集试验,应产生特异性凝集。

4 保存与效期

应保存于2~8℃暗处,自杀菌之日起效期为1年半。